Enzyminhibition

Methode

• Testsystem: Gepoolte menschliche Lebermikrosomen (HLM)
• Bewertete CYP-Enzyme: CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 und CYP3A4/5
• UGT-Enzyme, die auf Anfrage in direkten Inhibitionstests bewertet wurden: UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT11A6, UGT1A9, UGT2B7, UGT2B15
• Testartikelkonzentrationen: 8 Konzentrationen in dreifacher Ausführung
• Alle Probenvorbereitungen und Inkubationen werden mit einem automatisierten Liquid-Handling-System von Hamilton Microlab Star durchgeführt

Die CYP-Hemmung wird sowohl in direkten als auch in abhängigen Assays gemessen. Ein CYP-selektives Substrat wird in einer Substratkonzentration verwendet, die die Hälfte der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit (K_m) für jedes CYP-Enzym erreicht (siehe unten). Bekannte Inhibitoren werden als positive Kontrollen sowohl für direkte als auch für metabolismusabhängige Inhibitionstests verwendet. Alle Inkubationen werden durch Zugabe von gekühltem Acetonitril beendet, das einen stabil markierten internen, für das CYP-Substrat spezifischen Metabolitenstandard enthält.

Zeitabhängige (irreversible) Hemmung

Assays unter Verwendung von 8 Konzentrationen des Testartikels werden mit und ohne NADPH für 30 Minuten vor der Verdünnung in eine Sondensubstrat-Testmischung inkubiert. Wenn eine deutliche, zeitabhängige Hemmung beobachtet wird, können zusätzliche kinetische Parameter bestimmt werden, einschließlich der Inaktivierungskonstante (k_inact) und der Hemmkonstante (K_I). Diese Parameter, die experimentell durch Variation der Vorinkubationszeit und der Inhibitorkonzentration bestimmt werden, können dabei helfen, das Potenzial für Wirkstoff-Wechselwirkungen zu definieren.

Direkte Hemmung

Assays werden ohne und mit 8 Konzentrationen des Testartikels durchgeführt, um das Inhibitionspotential zu bestimmen und wo möglich einen IC50 zu definieren.

Die direkte Hemmung kann weiter charakterisiert werden, indem die Hemmkonstante (K_i) und die Art der beobachteten Hemmung unter Verwendung von 5 Konzentrationen des Sondensubstrats bestimmt wird.

Ergebnisse

Diese Assays liefern IC₅₀-Werte für die direkte oder irreversible Hemmung von CYP-Enzymen. Wenn eine signifikante direkte Hemmung beobachtet wird, kann die Hemmkonstante (K_i) bestimmt werden. Wenn eine signifikante zeitabhängige Hemmung beobachtet wird, können die mechanismusbasierten Inaktivierungsparameter (K_I und k_inact) bestimmt werden. Mit diesen Parametern kann die Pharmakometrie zusätzliche Hinweise bei der Beurteilung der Notwendigkeit einer klinischen Studie geben.