Die ddPCR-Technologie basiert auf der Teilung von Nukleinsäure-Proben in zehntausende Mikrotropfen festgelegten Volumens in einer Wasser-Öl-Emulsion. Die Amplifikation der Nukleotidsequenzen wird innerhalb jedes Mikrotropfens per einheitlichem Verfahren durchgeführt und es werden dieselben Reagenzien genutzt, die auch bei einem standardmäßigen probenbasierten TaqMan®-Assay Anwendung finden. Abhängig von der Fluoreszenzdetektion nach der Amplifikation wird jeder Mikrotropfen gezählt und entweder als PCR-positiv oder als PCR-negativ klassifiziert. Die DNA-/RNA-Matrizenkonzentration (Kopien/µl) in der Originalprobe wird mithilfe einer Poisson-Verteilung quantifiziert.1,2
Die ddPCR-Technologie ermöglicht eine absolute Quantifizierung von Nukleotidsequenzen pro Probenvolumen ohne Hochrechnungen aus Standardkurven oder Referenzstandards. Die Technologie kann in sehr geringen Probenvolumen geringe Unterschiede identifizieren, die von der qPCR-Technologie nicht erkannt werden. Die ddPCR-Technologie liefert aufgrund Tausender Datenpunkte pro Probe präzisere und empfindlichere Ergebnisse.
Die ddPCR-Technologie kann alle Arten von DNA- und RNA-Sequenzen identifizieren, für die Primer und Marker entwickelt werden können, einschließlich ctDNA, cfDNA/RNA, mRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, miRNA und siRNA.
Die ddPCR-Technologie kann für jede Probe genutzt werden, die DNA- oder RNA-Sequenzen erhält, beispielsweise Zell- und Gewebelysate, Gewebe, biologische Flüssigkeiten (Blut, Rückenmarksflüssigkeit, Tränen, Urin, Speichel etc.), Zellüberstand oder künstliche Nukleinsäure.
Eine ddPCR-Analyse dauert wie eine qPCR-Analyse üblicherweise ungefähr vier Stunden. Bei der ddPCR-Analyse ist ein zusätzlicher Schritt erforderlich, um die zehntausenden Öl-Mikrotropfen mit einem Volumen im Nanoliterbereich zu erzeugen. Allerdings wird dieser zusätzliche Zeitaufwand durch die Zeitersparnis der vereinfachten digitalen Analyse des ddPCR Reader ausgeglichen.
Proben extrahierter/isolierter/gereinigter DNA/RNA können mit dem Bio-Rad QX200 ddPCR System direkt analysiert werden. Zellüberstände und Zell-/Gewebelysate erfordern eine Extraktion/Isolation/Reinigung der DNA oder RNA, bevor das ddPCR-Assay durchgeführt werden kann. Um die Sicherheit des Laborpersonals von Labcorp zu gewährleisten, müssen Gewebe, biologische Flüssigkeiten und Zellüberstände zuerst auf Pathogene getestet werden. Darüber hinaus muss für alle menschlichen Materialien (Gewebe oder Körperflüssigkeiten), Mikroorganismen oder Viren, Produkte, die in biologischen Systemen generiert wurden und potenziell Gefahrenstoffen ausgesetzt waren und rekombinanten und/oder künstlichen Nukleinsäuremoleküle ein Registrierungsformular zur Sicherstellung der Biosicherheit ausgefüllt werden und nachfolgend ist eine Zulassung durch das Labcorp PCO Biosafety Committee erforderlich, bevor mit diesen Materialien gearbeitet werden kann.
Falls Sie vor dem Verschicken der Proben zur ddPCR-Analyse keine DNA/RNA extrahieren/isolieren/reinigen, empfiehlt das Labcorp PCO Biosafety Committee, die Nukleinsäuremoleküle in Zell- und Gewebeproben mit einer Konservierungslösung (beispielsweise RNAlater®, DNA/RNA Shield™ oder RNAprotect®) zu schützen/stabilisieren/konservieren, ehe Sie die Proben einfrieren und verschicken.
Alle Proben müssen in einem isolierten Behältnis mit Trockeneis verschickt werden.
1. QX200 Droplet Digital PCR system. BIO-RAD. https://www.bio-rad.com/en-us/life-science/digital-pcr/qx200-droplet-digital-pcr-system.
2. Taylor SC, Laperriere G, Germain H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Sci Rep. 2017;7:2409. doi:10,1/s41598-017-02217-x.
